摘要 透明质酸(Hyaluronic acid简称HA),是一种国际上公认的生物大分子保湿剂,用于眼科显微手术、关节炎治疗、高档化妆品、食品添加剂等领域。本文综述了目前国内外对透明质酸的化学结构、理化性质以及生产方法等方面的研究现状,对透明质酸的线性结构、超强吸水性以及它与水结合成的粘弹性透明水化膜,在润肤、恢复软组织等方面的应用作了较详细的论述,对采用动物组织为原料的提取法和采用兽疫链球菌等为菌种的发酵法作了较系统的介绍。
关键词 透明质酸;线性分子;保湿性;水化膜;提取法,发酵法
1 透明质酸的化学结构
透明质酸(Hyaluronic acid,简称HA),又名玻璃酸,是一种高分子量的直链多糖。1934年,Meyer首先从牛眼玻璃体中分离得到,它是由(1- 3)— 2—乙酰氨基— 2—脱氧— D—葡萄糖(1- 4)— D— D—葡萄醛酸双糖重复单位所组成的直链粘多糖。作为蛋白聚糖的结构核心,它与胶原、纤粘连蛋白、层粘连蛋白一起,广泛分布在动物和人体组织和细胞外基质中,对细胞运动、增殖、分化和稳定细胞与组织的表现型等,均有重要作用。透明质酸存在于结缔组织如关节、玻璃体、滑液、脐带、软骨、皮肤、鸡冠之中,以满足一些重要功能如韧性、支持结构以及细胞的代谢调节。透明质酸的结构非常规则,相同的双糖单位为透明质酸的基本结构单元,不同的动物组织与细菌来源的透明质酸无种属差异。
2 透明质酸的理化性质
透明质酸分子在溶液中高度伸展与随机卷曲构型使其占有很大区域,其流体力学体积较未水化时所占空间大1000倍。而且分子链之间互相缠绕形成连续的网状结构,水分子通过极性链与氢键与其直接作用,使得透明质酸像“分子海绵”一样,可以吸收与保持其自身重量上千倍的水分,是国际上公认的最好的保湿剂。
在结缔组织中,透明质酸分子的保水值大约为80ml/g,它比其他任何天然或合成的聚合物都具有更强的保水性。透明质酸的保水作用是其最重要的生理功能之一,故其被称为天然保湿因子。
此外,透明质酸还可以与蛋白结合成分子量更大的蛋白多糖分子,它是保持疏松结缔组织中水分的重要成分。若将蛋白多糖的糖链分解,则丧失保持细胞外水分的能力。分布在结缔组织中的蛋白多糖,通过氨基多糖与水结合,这种透明质酸—蛋白质—水形成的凝胶状态将细胞粘合在一起,发挥正常的细胞代谢作用及组织保水作用,并保护细胞不受病原菌的侵害,防止感染,使皮肤具有一定的韧性与弹性。
3 透明质酸的生理作用与应用
因为透明质酸具有保湿、营养、润肤等作用,故其广泛地用于各种高级化妆品中,与传统的保湿剂相比,透明质酸具有更高的保湿效果,且无油腻和阻塞皮肤等缺点。当HA加入化妆品中涂于皮肤表面时,会形成一层粘弹性透明水化膜,这层膜具有很好的保水作用,就像天然存在于细胞间质中的HA一样,能增加皮肤角质层的水分,而角质层的水分与皮肤健康的维持和对外界刺激的防御机能密切相关。由于透明质酸具有良好的持水能力,广泛地应用在
洗面奶、洗发香波、浴液中。
作为一种天然降解且具吸收性的生物医学材料,透明质酸在临床上用途十分广泛。单纯HA制剂在临床应用中有三种剂型:液体喷雾、胶体涂布及薄膜覆盖。可广泛应用眼科、耳科、骨科和普外科等,并已取得令人满意的结果。它的临床用途主要表现在三大方面:
3.1 在临床诊断学的价值
透明质酸水平在许多疾病中,呈现出明显的升高。临床上检测HA的血清含量水平,能反映出各种疾病的变化。研究证明,血清中透明质酸含量水平的变化与肝脏疾病的病程和肝细胞损害程度密切相关。作为诊断某些疾病的指标,HA体现出它独特的价值。
3.2 纯HA制品的临床使用价值
HA有极好的弹性,HA凝胶及其高度粘弹性可用于多种眼科显微手术,业已公认HA凝胶是眼科显微手术中的必备之物,它的应用是当今眼科显微手术中的一大里程碑。现在HA凝胶已作为必备的填充剂被广泛用于白内障囊外摘除术、人工晶体植入术、视网膜剥离术和角膜移植术等多种眼科手术。此外,HA还可用于泪道再通和干眼症等方面。近20年大量的临床应用已表明,HA粘弹物在眼科显微手术中的作用不仅仅是单纯的提供手术的空间,而且还具有粘弹性物衬垫作用、组织分离、软组织恢复器、黏性堵塞、黏性出血、粘弹性缓冲以及粘弹性固定等功能。随着科学的发展,现又提出应用HA时,应增加含大量负电荷的物质以期更有效地保护角膜内皮细胞。同时,对不同的眼科显微手术希望有相应配套的HA粘弹性物。其1%稀溶液临床上用于治疗干性角膜炎综合症。
透明质酸的润滑与缓冲作用,使其应用于骨关节炎、肩周炎与类风湿性关节炎的治疗。HA凝胶用于骨关节腔内注射治疗骨关节病是近年来在骨关节病治疗中的一大创举。大量的临床应用结果表明,应用HA作关节腔内注射治疗骨关节病,不仅克服了以前用激素治疗的副作用,而且近期和远期效果均优于激素,成为治疗骨关节病的首选材料。它的主要作用在于保护关节软骨、润滑关节腔、改善关节液和抑制疼痛,而且外源性高分子量的HA注射在关节腔内,改善了关节腔的生物环境,促进患者自身体内合成高分子量的HA。因此,一个疗程结束后,尽管外源性HA在数天后已进入代谢,但都可维持1年半— 2年。但注射低分子量HA时,则维持半年。现在临床应用于各种骨关节病、风湿性关节炎以及骨骨头缺血坏死,均获得较好的效果。
在各种外科手术中,HA能有效的促进伤口愈合,预防术后粘结。外科手术后组织粘结迄今为止尚无有效的预防和治疗方法。因此,如何预防外科手术后组织粘结和寻求治疗组织粘结是当今外科研究的重要课题之一。HA作为外科手术后防治组织粘结,使粘结的发生率大大降低,其应用效果在国内外的大量临床实践中均得到证明。HA防止术后组织粘结的机理是:1、HA凝胶具有高分子纤维网状结构,涂布于组织表面起到阻隔作用,在腹膜修复期起到一个暂时的屏障;2、抑制术后出血和渗血,减少能形成永久粘联骨架的数量,避免组织接触面的纤维旦白沉着;3、高浓度、高分子量HA抑制粒性白细胞迁徙和吞噬作用,并且抑制血小板的沉积,显示出HA的抗炎特性;4、HA与间质细胞和成纤维细胞表面的高亲和力和HA受体蛋白相互作用,提高这些细胞的迁徙能力并使其迁徙定向,从而改善内源性修复过程;5、HA凝胶覆盖于创伤浆膜表面,维持充足的时间不降解代谢,使早期的创伤组织修复规则而有序地生长,直至形成一连续的间皮细胞层覆盖于创伤表面,达到生理性修复。
鼓膜穿孔是临床中常见的疾病,由急、慢性中耳炎,外伤等引起。虽然大多数鼓膜穿孔可自行愈合,但有些则无法自行愈合,必须通过手术修补才能恢复。手术修复鼓膜常会引起术后原有鼓膜结构改变,影响听力的恢复程度,这主要与瘢痕组织形成及使用的移植材料有关。为了改善修复鼓膜的质量,使听觉功能最大程度的恢复,需要建立一种新的更好的治疗手段。近年来,国内外探索医用透明质酸钠在耳鼓膜修补中的应用,取得了可喜的成果。总结大量的临床结果,表明透明质酸钠治疗鼓膜穿孔是可行的,无任何副作用,是治疗干性鼓膜小穿孔的良好手段。
3.3 HA加药物作缓释试剂或诱导靶向
HA作为一种载体,可将各种药物导向送到各病理部位。让药物定位于作用部位同时缓慢释放,这样可大大增强药物的疗效。
4 透明质酸的生产
HA广泛存在于动物的各种组织细胞间质中,如皮肤、关节滑液、软骨、眼玻璃体、鸡冠、鸡胚等。其中以人的脐带、公鸡冠、关节滑液与眼玻璃体含量最高。透明质酸的传统提取方法是采用动物组织为原料,从人脐带、鸡冠、牛羊眼珠的玻璃体、鲸鱼软骨中提取透明质酸。这些动物组织必须是新鲜采集的,并经过冷冻处理。上述动物组织来源困难、价格昂贵,而这些动物组织中透明质酸含量很低、产品收率低。在提取过程中,必须使用大量的有机溶剂和酶,工艺复杂、操作单元多,使透明质酸的成本大大增加。此外,从动物组织中提取的方法生产的透明质酸杂质含量高,精制困难。但是因为其成本高,来源有限,纯化复杂,故不能满足日益扩大的需要。为了寻找HA的新来源,降低成本,这就促进了透明质酸的发酵法生产。
从70年代开始,有人利用微生物培养来制备透明质酸。日本资生堂于1985年首次报道了用链球菌生产HA的方法。已报道的常用的产透明质酸菌主要为伯杰氏手册中链球菌的A组与C组,如化脓链球菌(Streptococcus pyogenes A群)、兽疫链球菌(Streptococcus 200epidemicus(群))、马疫链球菌(Streptococcus egui c群)、类马链球菌(Streptococcuseguismilis c群)、缺乳链球菌(c群)、鸡霍乱杆菌等。A群主要是化脓链球菌等,系人体致病菌,较少使用,不宜作为生产菌种。C群链球菌为非人体致病菌,比较适合于工业生产。国外近年来利用C群链球菌生产透明质酸已达到产业化阶段。
表1 提取法和发酵法生产HA的比较
项 目 | 提 取 法 | 发 酵 法 |
存在状态 | 在原料中与蛋白质和其它多糖形成复合体,分离精制复杂 | 在发酵液中游离存在,分离精制容易 |
分子量与保湿性 | 小于10*105,保湿性差 | 大于15×105,保湿性强 |
品质与产量 | 取决于动物原料的品质与数量 | 品质稳定,产量大 |
价 格 | 100万日元/kg | 50- 60万日元/kg |
应 用 | 价格昂贵,化妆品中的添加量受到制约 | 能增加化妆品的添加量 |
菌种从保藏机构获得或从动物的鼻粘膜或眼结膜分离得到,这些现有的菌种大多数都产透明质酸酶,HA发酵产率低。发酵产率较高的菌种一般是经过诱变得到。诱变的方法为紫外线照射或诱变剂处理。日本专利报道了一种用NTG(N-甲基- N-硝基-亚硝基胍)诱变的方法:原始菌种是从牛鼻黏膜分离得到的,经鉴定为兽疫链球菌,为β溶血型,产HA也产透明质酸酶。为了克服原菌种的不利因素,进行了两步诱变:第一步用NTG处理后,接种于血琼脂培养基上进行培养,收集无β溶血素的变种;对此再进行第二步NTG处理,分别鉴别得到不产生透明质酸酶的变种。此诱变菌种在发酵过程中HA只合成不酶解,可在发酵液中不断积累,发酵产率高达6.7g/l,分子量≥10×105;未经诱变的原菌种发酵产率仅为2g/l,分子量为3×105-6×105。两步处理的诱变率分别为4×105和5×105,即从几十万甚至上百万个细菌中才能得到一个所需的变种,工作量之大是可想而知的。
国内研究水平较低,未达到工业化。HA生产当前仍处于脏器提取阶段,主要原料为脐带和鸡冠。上海大学学报报道了一种利用猪皮提取透明质酸的方法,生产得到的透明质酸分子量约为106。有人利用微生物发酵方法生产透明质酸,产量有报道为4.6g/l,但分子量仅有50万。
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